2. FONAMENTS TEÒRICS

2.1 Fonaments de la fermentació

El terme fermentació prové de descriure l'ebullició o efervescència que es produeix per efecte del creixement de llevats al desprendre CO₂en extractes de fruites i gra maltejat durant la producció de begudes alcohòliques.

En un sentit més ampli, sovint utilitzat a nivell industrial, s’entén per fermentació tot procés en que el producte desitjat és obtingut pel creixement controlat i/o per l’activitat d’un microorganisme.

2.1.1. Tipus de microorganismes d'interès industrial

• Llevats. Indústria del pa i begudes alcohòliques. Alguns exemples són: Saccharomyces cerevisiae (fabricació de cervesa, vi, pa i alcohols industrials), Kluyveromyces fragilis (fabricació d'alcohol a partir del sèrum de la llet), Yarrowia lipolytica (àcid cítric).
• Fongs filamentosos. Bolets, derivats de soja i certs formatges. Producció de diferents enzims, com les pectinases (útils per a l'elaboració de sucs). Síntesi d'àcids orgànics (cítrics i làctics). Síntesi d'antibiòtics com la penicilina. Alguns exemples són: Aspergillus niger (sobretot en la síntesi d'àcids orgànics) i el Penicillium notatum (Penicilina).
• Bacteris. Bacteris de l'àcid acètic, Gluconobacter i Acetobacter (poden convertir l'etanol en àcid acètic. El gènere Bacillus és productor d'antibiòtics (gramicidina, bacitracina, polimixina).Clostridium acetobutylicum pot fermentar els sucres donant com a producte acetona i butanol. Els bacteris de l'àcid làctic inclouen, entre altres, les espècies dels gèneres Streptococcus i Lactobacillus que produeixen el iogurt.

2.1.2. Cultiu de microorganismes. Factors que influeixen

És un procés de tipus autocatalític, ja que el producte del seu metabolisme i creixement és l’augment de la seva concentració. El metabolisme cel·lular, a nivell bioquímic, es pot dividir segons si es tracta de reaccions de degradació o de biosíntesi.

En les reaccions de degradació de substrats, el catabolisme, es dóna una sèrie de reaccions que subministren principalment l’energia i els monòmers que conformaran els precursors dels components cel·lulars i en les de biosíntesi, l’anabolisme, tenen lloc les reaccions de síntesi de molècules complexes i els seus precursors intermediaris. Aquestes dues activitats estan estretament lligades a nivell metabòlic.

Respecte la temperatura òptima de creixement, trobem microorganismes que creixen a temperatures per sota de 20ºC (psicròfils), altres amb una temperatura òptima entre 20 i 45ºC (mesòfils) i altres per sobre de 45ºC (termòfils). L’Escherichia Coli creix òptimament a 30ºC. El pH òptim pel creixement de la majoria de microorganismes, L’Escherichia Coli entre ells , es troba prop de la neutralitat (pH 7.0) tot i que la majoria són resistents a pH àcids de fins a 5.0 i bàsics de fins a 8.0. Hi ha algunes excepcions, com els bacteris de l’àcid làctic que suporten bé valors de pH inferiors a 5.0, o algues que viuen en ambients amb valors de pH per sobre de 10.

Tots els microorganismes necessiten per a la seva activitat la presència de varis nutrients. Els carbohidrats són els nutrients més utilitzats per tots ells. La glucosa és el sucre emprat preferentment per la majoria com a font de carboni i energia. Les necessitats de nitrogen són també importants. L’obtenen fonamentalment de fonts orgàniques proteiques però també a partir de sals d’amoni. Els aminoàcids, en la seva forma L-aminoàcid, són també requeriments nutritius pels microorganismes. També requereixen lípids com l’àcid linoleic o l’oleïc (àcids grassos de cadena llarga) encara que la majoria de microorganismes no els necessiten de forma essencial, ja que els poden sintetitzar a partir d’altres fonts. Els requeriments de vitamines i factors de creixement són molt variables entre els microorganismes. La majoria requereixen vitamines del grup B, més que no pas del grup A, C, D i K. Uns altres elements necessaris són el sofre en forma de sulfats i el fòsfor en forma de fosfats. Finalment els elements minerals són nutrients requerits per molts microorganismes a concentracions traça com el Fe, K, Mg i Mn a més de Ca, Co, Cu, i Zn entre d’altres.

Pel cultiu de bacteris es requereix l’ús de medis apropiats que subministrin a les cèl·lules tots els nutrients i substàncies necessàries per a la síntesi del seu material cel·lular i per la generació d’energia, en les quantitats apropiades als requeriments específics dels microorganismes pels quals han estat dissenyats. Donada la gran varietat de microorganismes que existeixen s’han desenvolupat un important nombre de medis específics per assegurar el seu creixement.

Hi ha dos tipus de medi, segons la seva formulació:

• Medi complex. Està format a base d'hidrolitzats proteïcs que aporten els nutrients necessaris sense necessitat de conèixer estrictament la seva composició.
• Medi mínim o definit. Conté únicament productes de composició química definida i en quantitats conegudes.

Segons les seves qualitats físiques distingim els medis següents:

• Medis líquids
• Medis semi-sòlids
• Medis sòlids

Segons el seu ús distingim els següents medis de cultiu:

• Medi general. És aquell on hi creix tota mena de microorganismes, excepte aquells que necessiten d'unes condicions especials. Ex: Agar CLED.
• Selectius. Permeten seleccionar (afavorir) el creixement d'una espècie o grup determinats.
• Diferencials. Permeten identificar una espècie o grup pel seu creixement ja sigui pel seu metabolisme, respiració, etc. Ex: Medi de McConkev.
• Enriquiment. Són medis dissenyats per a permetre el creixement del màxim nombre d'espècies possibles. Poden utilitzar-se, per exemple, per a estudiar tots els microorganismes presents en una mostra.
• Mínim. Contenen la mínima quantitat de nutrients possible que permet el creixement d’una espècie.
• Transport. Està preparat per a servir d’emmagatzematge temporal a espècies mentre són transportades mantenint la seva viabilitat.

2.1.3. Creixement bacterià en discontinu

En un procés de cultiu en discontinu el creixement bacterià presenta normalment 4 fases diferenciades:

Figura 2.1. Cinètica de creixement d'un cultiu bacterià en discontinu. 4 fases: Fase de latència (I), Exponencial (II), Estacionària (III) i Mort (IV). (MADIGAN, Michael T. Brock Biology of Microorganisms).

• Fase de latència. En aquesta primera fase hi ha absència de creixement. La durada d’aquesta fase és molt variable i depèn principalment de l’estat fisiològic del cultiu inòcul i del volum d’aquest en relació amb el volum del medi. Les cèl·lules es preparen per dividir-se.
• Fase exponencial. Les cèl·lules comencen a dividir-se i el seu nombre augmenta de forma exponencial. el creixement es pot descriure quantitativament en funció del temps de duplicació cel·lular i la velocitat de creixement es manté constant i al seu valor màxim tot i que les concentracions de substrats i metabòlits en el brou van variant. Durant aquesta fase les cèl·lules assoleixen la màxima velocitat de creixement. Els temps de duplicació varien en funció del medi i condicions de cultiu entre 20 i 90 minuts i s’assoleixen concentracions de cèl·lules viables de fins a 109 cèl·lules per mil·lilitre.
• Fase estacionària. Un cop el substrat principal s’ha exhaurit, o quan s’han acumulat en el brou metabòlits tòxics, la velocitat de creixement disminueix fins aturar-se per complet. Durant aquesta fase la biomassa augmenta molt poc o es manté constant.
• Fase de mort. Un cop s’exhaureixen les reserves energètiques, les cèl·lules van morint. La velocitat de mort de les bactèries és molt variable, i depèn tant de l’ambient imposat com del propi microorganisme.

L’estratègia d’operació en discontinu-alimentat és una de les més emprades per tal de perllongar la fase exponencial de creixement per obtenir cultius d'alta densitat cel·lular. Es van addicionant substrats a mesura que la fermentació progressa. Les concentracions màximes de biomassa s’assoleixen emprant components complexos com l’extracte de llevat, les peptones i els casaminoàcids. L’addició de substrats crítics del medi de cultiu en petites concentracions permet mantenir la velocitat específica de creixement baixa i perllongar el creixement.